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PCR反应扩增产物出现多条带(杂带)解决方案
浏览次数:374发布日期:2024-07-08
  聚合酶链反应(PCR)技术是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)及适当浓度的Mg2+存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列两端,同两条模板的3’端互补,由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性→退火→延伸反复循环构成,即在高温下模板双链DNA变性解链,然后在较低温度下同过量引物退火,再在适中温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。理论上,经过N次循环可使特定片段扩增到2n-1,考虑到扩增效率达不到100%,所以通常经25到30次循环可扩增到106倍,足够后续实验展开。
 
  扩增产物出现多条带(杂带):
 
  1、 引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
 
  2、循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。
 
  3、 酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。
 
  4、退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
 
  5、 样品处理不当。
 
  6、 Mg2+浓度偏高,因适当调整Mg2+使用浓度。
 
  7、 若为PCR试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。
 
  8、 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
 
  9、 反应缓冲液未全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化全并全混匀。
 
  10、 引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
 
  11、 引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
 
  12、 模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。
 
  13、 外源DNA污染。确保操作的洁净。