您好,欢迎进入上海抚生实业有限公司网站!
一键分享网站到:
产品搜索
PRODUCT SEARCH
产品分类
PRODUCT CLASSIFICATION
您现在的位置:首页 >> 技术文章 >> ELISA实验标准曲线的技术疑难解读
ELISA实验标准曲线的技术疑难解读
浏览次数:467发布日期:2024-07-01
  标准曲线法也称为外标法或直接比较法,是一种简便、快速的定量方法,在ELISA实验中比较常用的一种分析方法。标准曲线做的好与坏会直接影响到实验的结果,甚至是关系到实验的成败。那么在ELISA实验中,这一方面该如何处理呢?
 
  一、ELISA实验标准曲线的技术解答内容:
 
  1.设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度,并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度,即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内,包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线,尽量要使实验样品的浓度在中间坡度*陡段,即曲线几乎成直线的范围内。
 
  2.采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度,这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。
 
  3.样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的,所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事,否则后面的实验结果无从谈起。
 
  4.做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动,但一般来说,相关系数R至少要大于0.98,对于有些实验,至少要0.99甚至是0.999。
 
  6.检测标准样品时,应按浓度递增顺序进行,以减少高浓度对低浓度的影响,提高准确性。
 
  7.标准曲线的样品数一般为7个点,但至少要保证有5个点。
 
  标准曲线浓度得到后,可通过计算器、Excell或SPSS统计软件进行绘制,并得到相关的回归方程(即计算公式)和相关系数(回归系数)。
 
  二、选择什么方程去拟合
 
  用于免疫检测的所谓“标准曲线"其实称为拟合曲线比较合适。免疫检测时标准点(可以是倍比稀释的,也可以不是)浓度如果和相应的吸光度(OD)值如果能 够呈现直线关系当然是理想的了,这时可以通过EXELL等方便的获得拟合曲线,进而推算出样品的浓度值。但我们做免疫检测很少有时候能够有这么理想的情 况,标品浓度和相应OD值往往是"S"型的曲线关系,这时就不能用直线拟合的方式了,而对拟合方法进行选择就是必要的了。
 
  关于标准曲线的拟合方式,直线、二次曲线、三次曲线、指数、对数等虽都可用于ELISA及其它生物学反应中的曲线拟合,但都只适用于曲线的一部分,有的 适用于前半段,有的适用于后半段,有的适用于中间一段,而Logistic曲线则对曲线的全部都有较好的适用性。当然,如果用于定量,还是在中间一段较 好。这些方法虽然没有一种方法可以通用,但也都可以用。关键在于你的标准曲线做到了S形的哪一部分,你想检测的样品浓度在曲线的哪一部分。在S曲线的低浓 度部分可以用乘幂方程很好的拟合,中低浓度部分可以用直线方程,中间部分可用对数方程,而中后段可用四参数。
 
  目前国际上流行的免疫检测拟合方式是“四参数逻辑拟合",用这种拟合方式往往能够比较精确的反映浓度和吸光度的曲线关系,从而进一步比较正确的获得样品中待测物质的浓度值。
 
  其实,在一个长的区间内,Logistic应该都能拟合得较为理想。但并不是说它就是万能的。事实上不仅是ELISA,其它很多生物学反应都是S形曲 线,也都可以用Logistic曲线拟合。但建模型是一回事,而用它来定量是另一回事。如果用来定量,S形曲线的中间段(较陡处)是比较好的,而两端的平 坦部分计算误差会大,有时甚至会很大。