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逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)实验操作步骤
浏览次数:249发布日期:2024-05-17

        逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)可以:(1)分析基因的转录产物;(2)获取目的基因;(3)合成cDNA探针;(4)构建RNA高效转录系统。

实验原理:

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。


实验步骤:

一、总RNA的提取
总RNA提取可以:(1)获得高纯度、高质量的总RNA;(2)可以满足生物学下游实验Northern Blot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR 和阵列分析所需。

二、cDNA第一链的合成
目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

1. 在0.5 ml微量离心管中,加入总RNA 1-5 μg,补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μl。在管中加10 μM Oligo(dT)12-18 1 μl,轻轻混匀、离心;

2.70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min;

3. 取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA 2 μl;上游引物(10 pM) 2 μl;下游引物(10 pM) 2 μl;dNTP(2mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl) 1 μl。轻轻混匀,离心。42℃孵育2-5 min;

4.加入SuperscriptⅡ1 μl ,在42℃水浴中孵育50 min;

5. 于70℃加热15 min以终止反应;

6.将管插入冰中,加入RNase H 1 μl ,37℃孵育20 min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。

三、PCR
1.取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA   2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl;

2.加入适量的ddH2O,使总体积达50 μl。轻轻混匀,离心;

3.设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照;

4.电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果;

5.密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。


注意事项:

1.在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂;

2. 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照;

3.内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差;

4. PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定;

5. 防止DNA的污染: 采用DNA酶处理RNA; 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。