Real-time qPCR技术的定量原理：

一、扩增曲线

在Real-time qPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。

荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。

在Real-time qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期。

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入“平台期"。在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出初始模板量。

只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

                                                                 扩增曲线和Ct值

二、荧光阈值

为了便于对所检测样本进行比较，首先需设定一个荧光信号的阈值，荧光阈值是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值设置为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，但实际应用时要结合扩增效率、线性回归系数等参数来综合考虑。

通常荧光阈值都是Real-time qPCR仪器自动设置，如无特殊情况，无需更改。

三、循环阈值

循环阈值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数，Ct值与荧光阈值有关。

一般Ct值位于指数增长期的开始阶段，此时样品间细小物差尚未放大且扩增效率也相对恒定，因此该Ct值具有重复性，尽管平台期的DNA拷贝数波动很大，Ct值却是相对固定的。