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详细分析大豆PCR检测试剂盒中PCR反应五要素
浏览次数:502发布日期:2021-01-26
  大豆PCR检测试剂盒采用反应体系预先分装20ul反应液的模式,用户只需每孔加入5ul的DNA样品即可上机测试,大大提高了使用的便捷, 同时减少了交叉污染的机率。使用者需要几个PCR管就剪下几个PCR管来室温融化,避免整个试剂盒反复冻融,从而影响检测效果。
 
  大豆PCR检测试剂盒技术原理:
  DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
  在聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
  发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90°C以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
 
  大豆PCR检测试剂盒产品特点:
  1、灵敏度高,分析灵敏度可以达到50拷贝/uL,远高于常规方法,也比常规的PCR检测高100倍;
  2、特异性高,根据大豆Lectin基因的保守区设计引物,不会误检;
  3、一管封闭式,避免了PCR产物对后续PCR的污染;
  4、线性范围广,在10-107拷贝/uL的靶分子浓度范围内均呈线性;
  5、简单快捷,只需要2小时即可得到实验结果。
 
  PCR反应五要素:
  参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
  引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
  设计引物应遵循以下原则:
  1、引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
  2、引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
  3、引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
  4、避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
  5、引物3’端的碱基,特别是末及倒数几个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
  6、引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子很有好处。
  7、引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。