DOP-PCR即Degenerated Oligonucleotide Primed PCR(简并寡核苷酸引物聚合酶链反应)，它与普通PCR的区别在于其使用单一的半简并引物和低复性温度，半简并引物由特定序列+简并序列+特定序列三部分组成，因此没有种属特异性，也跟DNA的复杂性无关，能均匀地扩增真个基因组，尤其适用于痕量DNA样品的扩增。
 

　　产品及特点
 

　　本产品可用于不经过E.coli 培养和质粒提取而直接从转化子中筛选重组子，其原理是直接利用E.coli 菌落作为PCR模板，以识别载体质粒或/和插入片段顺序的寡核苷酸为引物对重组子进行筛查，通过PCR产物的有无和片段的大小来判断外源DNA片段是否被成功克隆到载体质粒之中，使用本产品可以使质粒鉴定过程从两天缩短到几小时。
 

　　1. 简单快速，用户只需要提供PCR引物和E.coli 菌落，不需要培养和质粒提取，整个筛选过程从一天缩短到2-3小时，节约时间和成本。本产品与常用E.coli 菌株和载体兼容。既可小规模筛选，也适用于大规模筛查。
 

　　2. 高灵敏度，既可用于高拷贝质粒，也适合于低拷贝质粒。
 

　　3. 高特异性，本产品采用了十分有效的办法控制了培养基上残留质粒对PCR的影响，使假阳性率低于5%，而绝大部分同类产品的十分容易出现假阳性。
 

　　4. PCR反应体系中含有惰性电泳染料，反映完成后可直接上样电泳，不需另加上样液。
 

　　5. 处理过的菌落样品低温长期保存后仍能用于PCR筛查。
 

　　6. 性价比高，价格更质粒提取试剂相当，但节约一天时间。
 

　　DOP-PCR试剂盒操作步骤：
 

　　(一)获得目的基因
 

　　1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点)，PCR循环获得所需基因片段。
 

　　2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
 

　　(二)构建重组表达载体
 

　　1、DOP-PCR试剂盒(DOP-PCR Kit)载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
 

　　2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
 

　　(三)获得含重组表达质粒的表达菌种
 

　　1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
 

　　2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
 

　　3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
 

　　(四)诱导表达
 

　　1、DOP-PCR试剂盒(DOP-PCR Kit)挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。
 

　　2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0(*0.6，大约需3hr)。
 

　　3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
 

　　4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀, 70℃10min。
 

　　5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。