ATCC细胞的原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

　　细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

 

　　ATCC细胞培养方法：

　　1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

　　①、弃去培养上清，用PBS或盐水清洗1-2次；

　　②、加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

　　③、1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

　　④、将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

　　⑤、用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

　　⑥、悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

　　2、细胞复苏：

　　①、将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

　　②、在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

　　3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

　　①、弃去培养上清，用PBS或盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶；

　　②、1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；

　　③、将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

　　④、将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

 

　　注意事项：

　　1、培养基于4℃条件下可保存3-6个月。

　　2、在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。

　　3、传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。

　　4、如果您的实验时间较长，请在收到细胞后传代时，按细胞量分种2瓶，使用其中的一瓶细胞实验，其余的细胞先冻存起来。下次实验需要时，再复苏。

　　5、该ATCC细胞，培养技术只可用于科研。