人组织蛋白酶C（Cathepsin C，CTSC，也被称为二肽基肽酶I）是溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族的核心成员，在免疫细胞激活、炎症级联反应、肿瘤侵袭转移等生理病理过程中发挥关键调控作用。本试剂盒为‌科研专用双抗体夹心法ELISA检测工具‌，可精准定量人源生物样本中的CTSC蛋白含量，不可直接用于临床诊断场景，以下为你提供覆盖全流程的详细说明：

þ核心检测原理

试剂盒采用经典的双抗体一步夹心法酶联免疫吸附体系：预先将高特异性的抗人CTSC单克隆捕获抗体包被在96孔微孔板表面，实验过程中依次加入待测样本、梯度标准品和HRP直接标记的CTSC检测抗体，经过恒温孵育后，在微孔板表面形成“捕获抗体-CTSC靶蛋白-HRP标记检测抗体"的特异性三明治免疫复合物。

经过多次充分洗板洗去所有未结合的游离组分后，加入TMB显色底物，TMB在HRP过氧化物酶的催化作用下逐步转化为蓝色反应产物，最终加入酸性终止液将反应终止，蓝色产物转变为稳定的黄色。最终反应体系的黄色深浅与样本中CTSC蛋白的实际含量呈严格的正相关关系，通过酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度OD值，即可通过标准曲线精准计算出样本中CTSC的实际浓度。

☎基础产品参数与市场规格

目前国内主流科研试剂厂商的人CTSC ELISA试剂盒已经形成标准化的产品体系，核心参数高度统一：

★试剂盒完整组分清单

96孔标准配置的试剂盒标配所有实验所需试剂，无需额外配制特殊缓冲液，开箱即可直接开展实验：

l 预包被CTSC特异性捕获抗体的96孔可拆酶标板条（12孔×8条），未使用完的板条密封后可在2~8℃干燥环境中额外保存1个月

l 梯度冻干CTSC标准品6管，每管0.3mL，复溶后可直接用于倍比稀释，剩余标准品分装后置于-20℃可长期保存6个月

l 样本专用稀释液6mL，适配各类复杂基质样本，大幅降低血清、血浆中的非特异性蛋白干扰

l HRP直接标记的CTSC检测抗体10mL，无需额外添加生物素-链霉亲和素体系，简化操作流程

l 20×浓缩洗涤缓冲液25mL，用蒸馏水按1:20比例稀释后即可使用，低温下析出的盐结晶37℃水浴助溶后不影响使用效果

l TMB底物A液6mL、TMB底物B液6mL，按1:1混合后即可用于显色，全程避光保存

l 2mol/L硫酸终止液6mL，用于终止酶促显色反应，操作时需佩戴防护手套避免直接接触皮肤

l 封板膜2张、自封袋1个、纸质产品说明书1份

★样本前处理专属规范

CTSC本身是活性jiqiang的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，样本处理不规范会直接导致靶蛋白降解、酶活性异常，最终检测结果大幅失真，必须严格遵循以下专属操作要求：

1、血清样本‌：静脉采血后立即置于无抗凝剂的真空采血管中，室温自然凝固30分钟，或4℃条件下过夜凝固，2~8℃ 1000×g离心20分钟，小心吸取上层清亮血清，绝对避免吸入下层血细胞沉淀，溶血样本严禁用于检测，红细胞破裂释放的大量内源性蛋白酶会直接降解CTSC靶蛋白，导致结果系统性偏低。分装后的血清置于-20℃或-80℃冻存，‌严格禁止反复冻融超过2次‌，反复冻融过程中蛋白三维结构破坏，抗原表位丢失，检测结果偏差可超过30%。

2、血浆样本‌：采血后立即注入EDTA或肝素抗凝管中，采集后30分钟内2~8℃ 1000×g离心15分钟，小心吸取上层血浆，可在样本中提前加入适量半胱氨酸蛋白酶抑制剂，抑制样本中内源性CTSC的酶活性，避免靶蛋白发生自降解。注意柠檬酸盐抗凝血浆未经过通用验证，使用前必须自行验证基质兼容性，叠氮钠（NaN₃）浓度>0.1%的样本绝对不能使用，其会不可逆地抑制HRP酶活性，直接导致显色失败。

3、组织匀浆样本‌：新鲜离体组织用预冷的0.01mol/L pH7.4 PBS缓冲液反复冲洗，去除残留血液，按1g组织对应9mL预冷PBS的比例加入缓冲液，‌必须在PBS中提前添加足量的蛋白酶抑制剂‌，冰上充分研磨匀浆，可辅助超声破碎进一步释放细胞溶酶体内的CTSC蛋白，5000×g 4℃离心10分钟，取澄清上清待测，避免匀浆中残留的细胞碎片引入非特异性干扰。

4、细胞培养上清/细胞裂解液样本‌：细胞培养上清收集后1000×g离心20分钟，去除悬浮细胞和细胞碎片，立即检测或分装后-20℃冻存；细胞裂解液采用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30分钟，12000×g 4℃离心15分钟取上清，BCA定量总蛋白后再进行后续检测，便于不同组间的结果标准化校正。

✦标准化详细操作步骤

所有试剂提前从2~8℃冰箱取出，室温平衡60分钟后再开始实验，标准品和待测样本全部建议设置复孔，zuida程度降低移液操作带来的随机误差：

1、板条准备‌：从铝箔袋中取出本次实验所需数量的酶标板条，剩余未使用的板条立即放回原自封袋中密封，重新置于2~8℃干燥环境保存。

2、标准品梯度配制‌：向冻干CTSC标准品管中加入对应体积的标准品稀释液，充分溶解后静置10分钟，得到20ng/mL的最高浓度标准品，随后通过倍比稀释依次得到10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL共6个梯度浓度，零浓度孔直接用标准品稀释液作为空白对照。

3、上样加样‌：设置空白孔、标准品孔、待测样本孔，标准品孔各加入不同梯度浓度的CTSC标准品50μL，待测样本孔先加入40μL样本稀释液，再加入10μL预处理后的待测样本（最终样本稀释倍数为5倍），加样时将液体直接加到孔底，避免触碰孔壁，轻轻晃动酶标板混匀。

4、温育孵育‌：除空白孔外，所有孔中各加入HRP标记的CTSC检测抗体100μL，用封板膜覆盖酶标板，置于37℃恒温箱中避光孵育60分钟，让抗原抗体充分结合形成稳定的三明治免疫复合物。

5、洗板操作‌：弃去孔内所有反应液体，在干净吸水纸上充分拍干，每孔加满350μl提前配制好的1×洗涤工作液，静置浸泡1分钟后甩干液体，重复洗板操作5次，最后一次洗板后拍干孔内所有残留液体，洗板不充分会直接导致背景本底异常升高，信噪比大幅下降。

6、底物显色反应‌：每孔依次加入TMB底物A液、TMB底物B液各50μL，轻轻晃动混匀，置于37℃恒温箱中避光显色15分钟，此时孔内液体逐步变为均匀的蓝色，当标准品最高浓度孔出现明显的深蓝色梯度时即可终止显色，避免显色过度导致高浓度孔信号溢出。

7、终止与读数‌：每孔加入终止液50μL，轻轻晃动混匀，蓝色液体立即转变为黄色，加入终止液后15分钟内，以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下依次测定各孔的OD吸光度值，读数前确认酶标仪充分预热稳定，避免读数延迟导致数值漂移。

♀结果计算方法

1、所有标准品和样本的OD值先扣除空白孔的本底OD值，得到校正后的有效吸光度值。

2、以标准品的CTSC浓度为横坐标，对应的校正OD值为纵坐标，使用四参数逻辑曲线拟合标准曲线，要求拟合相关系数R²≥0.99，确保标准曲线线性关系合格。

3、将待测样本的校正OD值代入回归方程，计算得到样本中CTSC的浓度，再乘以样本的初始稀释倍数，即可得到样本中CTSC的实际原始浓度。若样本OD值超出标准曲线最高浓度点，需用样本稀释液对样本进行进一步稀释后重新检测，最终结果乘以新的稀释倍数。

⚠CTSC靶标专属关键注意事项

1、样本采集后必须在30分钟内完成低温离心分离，长时间室温放置会导致CTSC从溶酶体中大量释放，同时发生自降解，最终检测结果失真。

2、不同批号的试剂盒组分绝对不能混用，超过保质期的试剂禁止使用，否则会直接破坏抗原抗体结合体系，导致实验失败。

3、洗板操作必须充分，每孔洗涤液充满微孔后静置1分钟再甩出，洗板不充分会直接导致背景本底异常升高，定量结果偏差超过20%。

4、实验全程避免强光直射HRP标记抗体和TMB底物，强光照射会直接破坏HRP酶的空间构象，导致酶活性大幅下降，显色信号系统性偏低。

❥核心科研应用场景

本试剂盒目前广泛应用于多个前沿科研领域：

l 炎症免疫研究：CTSC是中性粒细胞丝氨酸蛋白酶激活的核心上游调控因子，试剂盒可精准检测炎症性肠病、慢性阻塞性肺疾病等炎症模型中CTSC的表达动态变化，揭示炎症级联反应的激活机制。

l 肿瘤转移研究：CTSC在多种恶性肿瘤中高表达，可通过降解细胞外基质促进肿瘤侵袭转移，试剂盒可用于肿瘤患者血清中可溶性CTSC的定量检测，探索其作为新型肿瘤生物标志物的临床潜力。

l 药物研发筛选：针对CTSC的特异性抑制剂是新一代抗炎、抗肿瘤药物的研发热点，试剂盒可用于药物筛选过程中细胞上清、动物血清中CTSC的活性定量，评估抑制剂的体内外药效。

l 罕见病机制研究：CTSC功能缺失突变是导致掌跖角化病等遗传性疾病的核心病因，试剂盒可用于患者样本中CTSC蛋白表达水平的精准定量，辅助罕见病的分子机制研究。