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ELISA实验稀样本稀释问题论述
浏览次数:349发布日期:2024-06-03

      酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)是免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术,该测定依赖于抗原-抗体相互作用的原理,并利用酶和比色检测来量化目标分子,主要用于检测和量化生物样品中特定蛋白质、肽、抗体或抗原的存在。一个准确的ELISA检测实验,必须包含三大要素:性能可靠的试剂盒、造模成功并准确采集的样本、可控环境且严谨实验操作,三者缺一不可。在操作过程中,经常遇到样本稀释问题,需要进行样本稀释。

一、在ELISA实验过程中,超过试剂盒检测范围的,一般有这几种情况。
    样本值高的可能情况:
1、样本中待测物含量过高。一些高丰度蛋白来说,比如免疫球蛋白、脂联素、C肽、载脂蛋白等,在样本中本身含量就很高,有的达到mg/mL浓度。

2、一些受诱导表达的细胞上清中,大量表达,比如小鼠细胞诱导后,大量表达肿瘤坏死因子α(TNFα),小鼠胰岛细胞受诱导后,大量表达胰岛素(INS)。

3、在一些感染性疾病中,大量表达,比如乙肝表面抗原、C反应蛋白。

4、疫苗原性研究时,注射疫苗的小鼠,会产生大量针对疫苗的抗体。

5、一些被浓缩的样品,比如重组蛋白的产物,单克隆抗体纯品等。

 

二.在ELISA检测过程中,经常会遇到这样的问题:样本测定OD值超过标曲最高点OD值,造成测定数据无法直接使用。样本必须进行稀释,如何确定测定样本的稀释倍数?咱们先了解下    样本稀释容易犯的错误有哪些?

1、稀释不足。稀释倍数不足时,容易导致最终结果偏小。

2、过度稀释。过度稀释时,容易导致最终结果偏大。

3、稀释不够规范,引入很多人为偏差。稀释不够规范,特别是大比例稀释时,人为偏差大大增加。

 

三、如何确定测定样本的稀释倍数呢?样本稀释的原则如下:

在查询背景知识,或者通过预实验,确认了样本浓度过高,需要进行稀释,就要根据以下原则,严谨操作和计算。

1、稀释倍数合理。稀释后样本测定的OD值,要求落在标准品最高值OD值的半量程内,假定标准品最高值的OD值是2.4,那么稀释后的样本,OD值接近1.2,在这个范围附近,计算的浓度值最为准确,以这个结果乘以稀释倍数,得到的样本浓度最准确。

2、稀释过程规范。特别是大倍比的稀释,最好是梯度稀释。比如样本要稀释200倍,就先稀释10倍,再在10倍稀释的基础上,再进行稀释20倍,得到200倍。

3、样本取样量不要太小。在样本充足的情况下,样本取样量不要低于5uL,越低的取样量,在混匀取样过程中,误差越大。