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PCR 反应特异性提高的五大方法
浏览次数:3561发布日期:2023-01-16
  
 
  PCR 反应特异性提高的五大方法:
 
  1. 引物的设计
 
  引物最好在模板 cDNA 的保守区设计,长度 15-30bp,GC 含量小于 60%,3’端不超过连续三个 G 或 C,碱基分
 
  布错落有致,避免引物自身形成二聚体,设计完成之后,需进行 BLAST 检测,如果与其他基因不具有互补性,则可以进行下一步实验。
 
  2. 降落 PCR
 
  降落 PCR 是一种简单的降低非特异性产物的 PCR,最大的优点就是可以降低实验耗时,同时又可以优化实验的步骤。引物的设计决定退火温度,退火温度过高会使 PCR 效率过低,过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化,但费时费力。降落 PCR 提供了一个较为简易的优化方法。首先在较高的温度下扩增,此时虽然扩增效率低,但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低,非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势,因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制,从而大幅提高 PCR 的特异性和效率。
 
  3. 热启动扩增
 
  采用热启动方法进行扩增,是除了设计最佳引物之外,提高 PCR 反应特异性好的方式。在一般的 PCR 反应中,试剂的配置需在冰上进行,且要将 PCR 仪预热,这种方法就类似于热启动,能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温下也存在活性,只要体系中有 DNA 链存在,就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之前wan全抑制酶的活性,而zui有效的方法就是使用热启动 Taq 酶(或热启动高保真聚合酶)去扩增,它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心,当温度上升到 95℃时恢复活性,指导扩增。
 
  4. 巢式 PCR
 
  采用巢式 PCR 进行扩增,在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通 PCR 不同的是,它采用两对引物进行扩增,首先用第一对引物普通 PCR,然后将第一轮扩增的产物稀释 100 倍后用第二对引物(巢式引物)二次扩增。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度。