免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，它利用抗原抗体特异性结合的原理先将已知抗体标上英光素以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光从而可确定组织中某种抗原的定位进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便所以在临床病理诊断、检验中应用较广。

免疫荧光技术主要步骤:



1、冰冻切片制备:建议用新鲜组织否则组织细胞内部结构破坏易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等防止裂片和脱片。

2、组织切片固定切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定要及时固定和适当保存。

3、血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合需要在一抗孵音前先用血清(与二抗来源一致)封闭减弱背暴着色，血清封闭的时间是可以调整的一般10-30min。

4、一抗孵音条件在免疫组化反应中最重要包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵查温度有几种4度、室温。

37度其中4度效果更佳孵音时间这与温度、抗体浓度有关一般37度1-2h4度过夜(从冰箱拿出后37度复温45min)。具体条件还要摸索。

5、二抗孵育条件一般室温或37度30min-1h具体时间需要摸索而浓度一般有工作液若是浓缩液还要摸索浓度一定要避光反应，但在免疫荧光中我们一般先把三抗浓度和孵育时间先定下然后去摸索一抗浓度和邦育时间。最后荧光素标记的二抗随着保存时间的延长可能会有大星的游商荧光素残留需要注意配制时小包装和并进行适当的商心。

6、复染目的是形成细胞轮廊从而更好地对目标蛋白进行定位，一般常用DAPI复染。

7、封片:为了长期保存我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低直至接触到液体时为止当发现液体接触面在不断弥散时则可以缓慢降低另一拐角这样一般不会产生气泡。

8、切片清洗:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次而一抗孵育后的清洗均为5次*5min.

注意事项:

(1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染。

(2)温柔冲洗,防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式。

(3)冲洗的时间要足够,才能彻di 洗去结合的物质。

(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求(建议PH在7.4-7.6,浓度是0.01M;中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解。

9、拍照有条件的话更好立即拍照若不能及时拍照也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作不要随意改变程序应在暗室中进行检查防止紫外线对眼睛的摄害在调救光源时应戴上防护眼镜检查时间每次以1~2h为宜超过90min.超高压录灯发光强度逐渐下降荧光减弱标本受紫外线照射3~5min后荧光也明显减弱或褪色激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象:所以最多不得超过2~3h荧光显微镜光源寿命有限标本应集中检查，以节省时间,保护光源。天热时应加电扇散热降温新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时须待灯光充分冷却后才能点燃。中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后标本染色后立即观察因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚之烯塑料袋中4℃保存可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发,使用的玻片等载体都必须厚度均匀无明显的自发荧光如果使用油镜还必须保证镜油为无荧光镜油电源更好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命也会影响镜检的效果。

除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。
1、细胞固定和通透
为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。
2、抗体特异性
免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。
3、合适的抗体稀释比例
通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第1次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。
4、优化缓冲液和封闭剂
尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。Rockland可提供优化过的IHC用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。
5、选择正确的二抗
如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。
6、使用合适的细胞密度
选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。
7、多重染色
对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。
8、降低背景
高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替BSA做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为PBS+0.05%Tween。
9、封片
作为免疫荧光的最后一步，可以提高折射率，保护样品。
10、数据分析
观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。