支原体PCR检测试剂盒怎么用？反应要素有哪些？
浏览次数：583发布日期：2019-12-16
支原体是一类缺乏细胞壁的原核生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。它不同于细菌，也不同于病毒，种类繁多，分布广泛，造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域。牛支原体（MycoplasmaBovis）是重要的致病性牛寄生支原体，呈流行趋势，可引起牛肺炎、关节炎、等多种疾病，发病率达到60%-100%，但病死率不高。牛支原体并不总是引起牛的疾病，在健康或患病的牛身上均可发现其存在。由于牛支原体的疾病表现和对治疗和疫苗的反应常发生变化，对它的诊断和控制较为困难。
对牛支原体的检测，可以通过血清学方法（如免疫荧光法和免疫印迹法），或遗传学方法（如基于RRS基因的PCR法或寡核苷酸互补配对），进行检测。后来的研究发现牛支原体的实验室菌株和野外分离获得的菌株存在抗原和遗传学上的变异，对上述检测方法形成了干扰。
基于稳定的管家基因的PCR可以排除上述变异的干扰。因此，牛支原体PCR检测试剂盒选取了一个种内变异很小的与DNA修复有关的基因进行PCR鉴定，引物经BLAST验证为特异性靶向牛支原体，与其他生物的基因组不产生交叉反应。使用本试剂盒检测了22种不同的牛或羊寄生性支原体，仅有牛支原体产生特异性扩增条带。而对13个实验室或野外分离的牛支原体菌株，本试剂盒均可产生特异性扩增条带。可见本试剂盒具有物种特异性，可用于牛支原体的鉴定和检测。
本试剂盒利用两对引物通过巢式PCR法特异性扩增支原体基因组DNA片段，从而实现对支原体的高灵敏度特异性检测。在编码16S和23S的保守区DNA上设计一对F1/R1引物，用于扩增16S和23S之间的间隔区，这就是巢式PCR的第一轮PCR(1stPCR)，用于初步鉴定是否有支原体污染；然后在编码16S和23SrRNA的DNA间隔区的保守区上设计一条F2引物，在编码23SrRNA的DNA上设计一条R2引物进行巢式PCR的第二轮PCR(2ndPCR)。
每个试剂盒都配有阳性对照，便于确定PCR检测是否能正常工作，及样品中是否存在抑制PCR反应的物质。
利用PCR法检测试剂盒不仅能够检出是否有支原体污染，还能根据条带大小确定支原体种类，可谓是一举两得！
使用方法：
一、发酵支原体PCR检测试剂盒样品RNA的制备
1、用自选方法抽提病毒样品RNA。注意：可以选用本公司的一管式病毒RNAout
2、或柱式病毒RNAout。
二：RT（逆转录）反应合成cDNA
1.按下表配制RT反应体系（20μL体系）
2.70℃保温5分钟变性模板后立即冰浴。
3.严格按顺序加入6μLRTBuffer（含dNTP）和2μLMMLV逆转录酶（含RI），反应终体积为20μL。
4.42℃保温60分钟。此步为RT反应。
5.70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，丌需要纯化。
注意事项：
①加入试剂的顺序，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
②使用干净的塑料容器配置洗涤液。
③按照鸡血红蛋白(HB)ELISA检测试剂盒说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
④底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
⑤洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
⑥使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
⑧试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
支原体PCR检测试剂盒反应要素：
发酵支原体PCR检测试剂盒参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是底部及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
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