NAD激酶(NADK)测试盒(比色法)
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货号 | 产品名称 | 规格 |
AS63212 | NAD激酶(NADK)测试盒(比色法) | 100管/48样 |
AS63212 | NAD激酶(NADK)测试盒(比色法) | 50管/24样 |
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
NADK(EC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是目前所发现的生物体内惟一能够催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶,可催化NAD(H)以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应,生成NADP(H)。因此,NAD激酶在合成NADP(H)以及调节NAD(H)与NADP(H)的平衡上具有重要作用。
测定原理:
NADK催化NAD+磷酸化,生成NADP+;NADP+可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH;在340 nm下测定NADPH增加速率。可反映出NADK活性的大小。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体100 mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体10 mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:液体25 mL×1瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1瓶,-20 ℃保存;
试剂四:粉剂×1瓶,-20℃保存;
样本测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、将试剂一和试剂二37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min以上。
3、工作液Ⅰ的配制:在试剂三中加入5mL试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
工作液Ⅱ的配制:在试剂四中加入18mL试剂二,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
4、加样表
试剂名称(μL) | 测定孔 | 对照管 |
样本 | 20 | 20 |
工作液Ⅰ | 80 | |
试剂一 | 80 |
充分混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min,立即煮沸
2min(盖紧,防止水分散失)冰浴冷却,10000g,25℃离心10min,取上清
上清液 | 40 | 40 |
工作液Ⅱ | 160 | 160 |
加完试剂混匀,室温静置15min,340nm下测定吸光值,ΔA=A测定-A对照。
NADK活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)NADK活力的计算:
单位的定义:每mL血清(浆)每分钟生成1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=53.59×ΔA
2、组织、细菌或细胞中NADK活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=53.59×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.107×ΔA
V反总:反应体系总体积,1×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,15 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)NADK活力的计算:
单位的定义:每mL血清(浆)每分钟生成1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=107.18×ΔA
2、组织、细菌或细胞中NADK活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=107.18×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=107.18×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.214×ΔA
V反总:反应体系总体积,1×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,15 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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