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测定意义

GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

测定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。

需自备的仪器和用品

分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体14uL×1支，4℃保存；

组织样本的前处理

①总GAPDH酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆GAPDH酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中GAPDH酶活性。

建议测定总GAPDH酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH，则按照步骤②提取粗酶液。

细菌或培养细胞的前处理

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定

（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在试剂三中加入500μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL样本、5μL试剂三和190μL工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录340nm处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

GAPDH活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500 ×V样÷V样总) ÷T=2.572×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.005 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=2572×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500 ×V样÷V样总) ÷T=5.144×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.005 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

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