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测定原理：

在弱酸性条件下，FFA与铜盐反应生成铜皂，在715nm处有特征吸收峰，在一定范围内游离脂肪酸含量与显色程度呈线性关系。

自备仪器和用品：

研钵、台式离心机、震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。

试剂组成和配制：

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体20mL×1瓶，4℃保存。

样品中FFA提取：

组织用蒸馏水冲洗干净后，用吸水纸吸取表面水分，捣碎后按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）加入试剂一，震荡提取3h，8000g，4℃离心10min，取上清液待测。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到715 nm。

2. 对照管：取上清液0.4mL，加0.2mL试剂二，充分震荡5min，室温静置5min，取上层200μL于微量石英比色皿/96孔板，调零。

3. 测定管：取上清液0.4mL，加0.2mL试剂三，充分震荡5min，室温静置5min，取上层200μL于微量石英比色皿/96孔板，测定吸光值，记为A。

FFA含量计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y=0.0075 x+ 0.0055，R2=0.994

（1）按样本蛋白浓度计算

FFA（nmol/mg prot）= (A-0.0055)÷0.0075×V1÷(V1×Cpr)=133×(A-0.0055)÷Cpr

（2）按样本质量计算

FFA（nmol/g 鲜重）= (A-0.0055)÷0.0075×V1÷(V1÷V2×W)=133×(A-0.0055)÷W

V1：加入样本体积，0.4mL；V2：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y=0.0038 x+ 0.0055，R2=0.994

（1）按样本蛋白浓度计算

FFA（nmol/mg prot）= (A-0.0055)÷0.0038×V1÷(V1×Cpr)=266×(A-0.0055)÷Cpr

（2）按样本质量计算

FFA（nmol/g 鲜重）= (A-0.0055)÷0.0038×V1÷(V1÷V2×W)=266×(A-0.0055)÷W

V1：加入样本体积，0.4mL；V2：提取液体积，1mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。

注意事项：

1. 蛋白含量不可直接用提取的上清液直接测定，可用蒸馏水或缓冲液或生理盐水选用本公司的BCA法蛋白含量测定试剂盒。

2. 检出限为2 nmol/mL。

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