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测定意义：

游离脂肪酸，也称为非酯化脂肪酸，在与白蛋白结合的血浆中循环。动物血液中的游离脂肪酸 (FFA )含量是一项重要的生理生化指标。血清中游离脂肪酸的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关，游离脂肪酸的浓度会因为糖尿病、重症肝障碍、甲状腺功能亢进等疾病而上升。

测定原理：

用有机溶剂萃取FFA。含有FFA的有机液与三乙醇胺铜反应,在有机相中形成脂肪酸铜 (铜皂) FFA一Cu。Cu离子与显色液反应形成紫红色络合物。反应形成的颜色深浅与Cu离子浓度的关系符合朗伯一比尔定律，因此可利用此反应进行比色。

自备的仪器和用品：

酶标仪、离心机、可调式移液器、96孔板、蒸馏水。

试剂的组成和配制：

萃取液：液体 120 mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 15 mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体 15 mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，室温保存；

试剂四：液体 12 mL×1瓶，4℃保存；

样本前处理：

1.动物组织：按照动物组织质量（g）：萃取液mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL萃取液），进行冰浴匀浆。震荡提取15min，5000 rpm 4℃离心5min，取有机相待测。

2.血清：吸取50 μL血清样本，加入1 mL萃取液，震荡提取15 min后，4℃，5000 rpm离心5 min，取有机相待测。

3.微生物、细胞：按照细胞数量（104个）：萃取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1 mL萃取液）加入萃取液，冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声2秒，间隔3秒，总时间3min）；震荡提取15 min，然后5000 rpm 4℃离心5min，取有机相待测。

注意：有机相待测液可能存在于上层，也可能存在于下层，注意观察，体积较多的那一层即为有机相待测液。

测定步骤：

1. 酶标仪预热30min以上，调节波长至550 nm。

2. 工作液的配制：临用前根据用量按照试剂一（V）：试剂二（V）：试剂三（m）=1（mL）：1（mL）：0.66（g）的比例充分混匀。（注意：现用现配，用多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有4个空瓶，先将试剂一与试剂二混合，最后再加入试剂三粉剂）

3、测定管：吸取600μL样本，加入200μL工作液，盖紧后震荡20 min，4℃，5000 rpm离心5 min，分层后取200μL上层有机相，加入100μL试剂四，摇匀，10 min后测定550 nm的吸光值，记为A测定。

4、空白管：吸取600μL萃取液，加入200μL工作液，盖紧后震荡20 min，4℃，5000 rpm离心5 min，分层后取200μL上层有机相，加入100μL试剂四，摇匀，10 min后测定550 nm的吸光值，记为A空白。

空白管只需测一次。△A=A测定-A空白

注意：1、有机溶剂易挥发，加入96孔板后应尽快检测。

2、测定管中加入的样本即样本前处理中的有机相待测液。

FFA含量计算：

标准曲线：y = 0.0161x - 0.0141     R2 = 0.9985   x：棕榈酸标准品浓度（nmol/mL）

                                            y：吸光值差值△A

1、血清FFA含量计算：

FFA含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000

                 =1.242×(△A+0.0141)

2、动物组织、微生物、细胞中FFA含量计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

FFA含量(μmol/g鲜重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷（W× V1÷V2）÷1000

                =0.062×(△A+0.0141)÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

FFA含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000

                =0.062×(△A+0.0141)÷Cpr

V1：加入样本体积，0.6mL；V2：萃取液体积，1mL；V3：加入血清（浆）体积，0.05 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：动物组织样品质量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。

注意事项：

蛋白含量不可直接用萃取液提取的有机相待测液直接测定，可用蒸馏水或缓冲液或生理盐水选用本公司的BCA法蛋白含量测定试剂盒。

检出限为20 nmol/mL。

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