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海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)测试盒

  • 更新时间:  2023-10-15
  • 产品型号:  AS012147
  • 简单描述
  • 海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)测试盒广泛存 在于细菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、 无脊椎动物和高等植物等多种有机体 中。
详细介绍

本网站销售的所有产品均不得用于人类或动物之临床诊断或治疗,仅可用于工业或科研等非医疗目的。

货号

产品名称

规格

AS012147

海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)测试盒

100管/48样

AS012147

海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)测试盒

50管/48样

测定意义:海藻糖是由两个葡萄糖分子以α ,  α- 1- 1  糖苷键连接而成的一种非还原双糖, 广泛存  在于细菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、 无脊椎动物和高等植物等多种有机体 中。海藻糖的非还原性决定了它对酸、碱、高温等的稳定性。另外, 它本身具有很强的吸水 性,使它在生物体内具有抗脱水作用,在逆境条件下可通过识别外界刺激、产生和传递信号、 基因表达和代谢调节来保护植物免受不良环境的伤害
植物体内主要以葡萄糖为底物合成海藻糖,该反应首先在海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase ,TPS)的作用下,催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和 6- 磷酸葡萄糖反应生成中间产物6-磷酸海藻糖, 再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶 (trehalose6-phosphate phosphatase ,TPP)的作用下去磷酸化,生成海藻糖。因此,测定TPS活性对于研究植物逆境具有重要意义。
测定原理:
TPS 催化 UDPG 与 G6P 生成海藻糖-6-磷酸,同时产生 UDP;UDP 在丙酮酸激酶与乳 酸脱氢酶作用下,氧化 NADH 为 NAD+,NADH 的下降速率与 UDP 含量成正比,通过 340nm 吸光度下降速率反映 TPS 活性。
需自备的仪器和用品:
分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶, 4℃保存;
试剂一:粉剂×1 瓶, -20℃保存; 临用前加入 10mL 试剂五溶解,用不完的试剂分装后-20℃ 保存,禁止反复冻融;
试剂二:粉剂×2 瓶, -20℃保存;临用前每瓶加入 25mL 试剂五溶解;现配现用;
试剂三:粉剂× 1 瓶, -20℃避光保存;临用前加入 0.1mL 试剂五溶解,用不完的试剂分装后 -20℃保存,禁止反复冻融;
试剂四:100μL×1 瓶, 4℃避光保存;临用前低速离心,以防止试剂沾在管壁;

试剂五:液体 100mL× 1 瓶,4℃保存;
工作液的配制: 临用前, 先配置好 1 瓶试剂二和试剂三, 然后在试剂二瓶中加入 25μL 试剂 三和 25μL 试剂四, 充分混匀,现配现用。
样品测定的准备:
1、细菌或细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量 (104 个): 提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液), 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3S,间隔 10S,重复 30 次) ;8000g ,4℃离心 10min,取上清, 置冰上待测。
2、组织的处理: 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液) ,冰浴中匀浆。 8000g  4℃离心 10min,取上清, 置冰上待测。 测定步骤

1 、在 EP 管中加入如下试剂

试剂名称(μL)

测定管

样本

150

试剂一

150

 

混匀, 30℃反应 20min ,95℃水浴 2min 灭活, 冷却至室温。10000g 4℃离心 5min,取上层 反应液待测。
2、工作液配制: 详见试剂的组成和配制中工作液的配制。
3、在 1mL 玻璃比色皿中加入如下试剂

反应液

100

工作液

900

 

混匀,测定 340nm 下 5min 后吸光值 A1 与 10min 后吸光值 A2 ,ΔA=A1-A2。
TPS 活力计算:
1、按照蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
TPS 活力(nmol/min/mg prot)=ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109÷(V 样×Cpr)÷T×3
=643×ΔA ÷Cpr
2、按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
TPS 活力(nmol/min/g  鲜重)=ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109÷(W× V 样÷V 样总) ÷T×3
=643×ΔA÷W
3、按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
TPS 活力(nmol/min/104  cell)=ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109÷(V 样×细胞数量)÷T×3
= 1.28×ΔA
V  反总:反应体系总体积,1mL;ε:NADH 摩尔消光系数, 6.22×103  L / mol /cm;d:比色 皿光径, 1cm;V 样:加入样本体积, 0.15 mL;V 样总:加入提取液体积, 1 mL;T:反应 时间, 5  min;3,稀释倍数;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量;细胞数量, 500 万。

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